Algunos aspectos del estudio de la célula, exigen su separación de otras, la separación de sus orgánulos o estructuras celulares.
Para conseguir la separación de los orgánulos podemos romper las células mediante el uso de una disolución hipotónica, por medio de ultrasonidos, por el batido mediante una especie de licuadora o por un aplastamiento en un tubo de vidrio con un embudo.
Pero...¿cómo separamos los distintos componentes celulares de una mezcla en la que se encuentran todos en suspensión?
La respuesta a esta cuestión es mediante centrifugación a elevada velocidad.
Ésta provoca el depósito de las partículas que están en suspensión según sean su tamaño, su forma y su densidad. El resultado de este proceso arrojará una serie de fracciones celulares separadas en el tubo de la centrífuga.
Una variante de este proceso, será la ultracentrifugación zonal o en gradiente de densidad . Ésta nos permite separar fracciones celulares con pequeñas diferencias de densidad.
Gracias a que la mayoría de las células pueden crecer en placas de cultivo , podemos observarlas in vivo, analizarlas bioquímicamente, o estudiar sus respuestas ante determinados estímulos, ante la falta o presencia de algunas moléculas, o incluso ante otras células.
Conseguiremos un cultivo celular a partir de una única célula, que experimentará mitosis, obteniendo un clon o línea de células genéticamente idénticas. Además, se pueden fusionar dos células distintas para formar un heterocarionte (célula con los dos núcleos originales). Los medios de cultivo pueden incluir glucosa, aminoácidos, sales minerales, vitaminas y factores de crecimiento específicos para cada tipo celular. Tiene gran importancia la naturaleza del sustrato, que puede ser sólido o líquido, la concentración y el pH.
Las células tienen un pequeño tamaño (entre 10 - 20micras de diámetro) y una gran complejidad. Para observar y estudiar su morfología se han desarrollado los microscopios.
Existen dos tipos, el óptico y el electrónico, los cuales presentarán a su vez diferentes variedades:
-Microscopio óptico compuesto, formado por unas lentas que permiten observar la imagen aumentada que se produce cuando la luz visible atraviesa un objeto. Una de las lentes, la lente objetivo, recoge la luz directamente de la muestra estudiada, mientras que la lente ocular, próxima al ojo del observador, aumentará la imagen formada por el objetivo. Este microscopio se corresponde con un microscopio de campo claro, pero existen otros tipos que se usan para diferentes propósitos:
-Microscopio de campo oscuro. Permite observar células no teñidas, las cuales aparecen iluminadas sobre un fondo oscuro,
-Microscopio de contraste de fases y de interferencia. Permite observar células vivas, ya que aprovechan las propiedades de difracción del interior de las células, con lo que se obtiene gran contraste aun sin colorante.
-Microscopio de polarización, utiliza la luz polarizada y sirve para detectar estructuras ópticamente activas que tienen una organización molecular semejante a la cristalina y distinguirlas de las que no lo son.
-Microscopio de luz ultravioleta utiliza este tipo de luz, que tiene una longitud de onda menor, por lo que se incrementa su poder de resolución. Aunque la luz ultravioleta no es visible, se aplica en la microscopía de fluorescencia, que se basa en la propiedad de las sustancias fluorescentes de captar energía de una longitud de onda determinada y emitir fotones de mayor longitud de onda. Las células serán tratadas previamente con una sustancia fluorescente que se fija a algunas estructuras celulares. En la técnica de inmunofluorescencia se utilizan anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes, que se unen específicamente a antígenos.
El poder de resolución de un microscopio es la distancia mínima entre dos puntos distintos que pueden verse separados mediante su utilización. Aunque depende del objetivo, tiene una limitación impuesta por el tipo de luz, ya que es del orden de la longitud de onda de la luz utilizada. La luz visible tiene una longitud de onda de 400 a 700nm, aproximadamente, por lo que las partículas de ese tamaño ( bacterias) son las más pequeñas que se pueden observar nítidamente. El límite de resolución alcanzado por el microscopio óptico es de 20nm, y se consiguió al final del siglo pasado.
Entre las características específicas que presenta un microscopio, están el número de aumentos y la profundidad de campo o poder de penetración.
El número de aumentos resulta de multiplicar los aumentos del objetivo por los del ocular.
El poder de penetración o profundidad de campo es el espesor del corte que aparece enfocado, que depende del objetivo utilizado: a mayor número de aumento, menor profundidad de campo.
El microscopio ótico y el electrónico mostrarán diferencias significativas, aunque ambos aportarán información muy relevante acerca de la morfología y la estructura celular.
Entre ellas destacar, que para observar las muestras al microscopio electrónico, éstas no se tiñen con colorantes, sino con sales de metales pesados ( como el plomo o el uranio).
Éstos se depositarán en las estructuras celulares de forma selectiva e impiden el paso de los electrones, por lo que las imágenes muestran zonas electroclaras y zonas electrodensas.
El microscopio electrónico utiliza como fuente de iluminación un haz de electrones que se obtiene al calentar un filamento de tungsteno (el cátodo) mediante una corriente eléctrica. Los electrones producidos por el cátodo se dirigen a gran velocidad hacia un ánodo, cargado positivamente, y pasa como un delgado rayo a través de un orificio que hay en su centro.
En los microscopios electrónicos normales, la diferencia de potencial entre el cátodo y el ánodo suele ser de hasta 100.000V. El control de haz de electrones para dirigirlo a la muestra se realiza por medio de lentes, que en realidad son electroimanes que permiten distintas aberturas.
La transmisión de los electrones desde el cátodo hasta la muestra ha de hacerse en el vacío para impedir que choquen contra los átomos o las moléculas del aire, lo cual impediría la visión. Por ello, este tipo de microscopios ha de estar dotado de una bomba de vacío y debido a las altas temperaturas que se generan, de un sistema de refrigeración, normalmente un circuito de agua.
Pero..¿ por qué se utiliza un aparato tan complejo para la observación de las células? ¿qué ventajas presenta?
Bien, pues la luz utilizada por este tipo de microscopio, o sea, el haz de electrones, tiene una longitud de onda mucho más pequeña que la de la luz visible, aunque puede variar en función de la diferencia de potencial a la que se le someta, hasta el punto de que el poder de resolución de este tipo de aparatos es del orden de 10 a 20 amstrong.
Existen dos tipos de microscopios electrónicos:
-M. E. de transmisión. (MET). En él los electrones atraviesan una fino corte de la muestra de tejido y se proyectan sobre una pantalla fluorescente, ya que no pueden observarse directamente. Las imágenes se pueden recoger mediante cámaras fotográficas. Hay que tener presente que el poder de penetración de los electrones es muy pequeño, por lo que los cortes deben ser muy finos, de 50 a 100nm. Para poder obtener cortes tan finos se emplea un aparato llamado ultramicrotomo, en el que se emplean cuchillas de diamante o de vidrio. Los tejidos deben estar incluidos en una resina sintética y los cortes se depositan sobre una rejilla de cobre.
-M. E. de barrido. (MEB). En este tipo de microscopio el haz de electrones no atraviesa la muestra sino que se refleja sobre su superficie. Los electrones reflejados son recogidos en una pantalla de televisión. Permite observar con gran profundidad de campo imágenes tridimensionales de la superficie de las estructuras estudiadas, pero su poder de resolución y su número de aumentos es menor que el del MET. Las muestras deben ser cubiertas por una fina capa de un metal pesado que permita que los electrones se reflejen.
Pero, con toda esta información, se podría pensar...¿es posible obtener un rendimiento aún mayor, del avance tecnológico que nos ha aportado el microscopio electrónico?
Realmente sí. Se consigue a través de la investigación y puesta a punto de nuevas técnicas, entre ellas, la criofractura.
Este proceso consiste en congelar la muestra de tejido a una temperatura de -196ºC mediante nitrógeno líquido, y fracturarla después, utilizando el filo de una cuchilla, con lo que se rompe siguiendo las superficies de menor resistencia.
Con el empleo del microscopio de barrido se pueden obtener imágenes tridimensionales, que pueden aportar nueva información sobre las estructuras celulares. Las superficies de criofracturas se pueden sombrear lateralmente con un metal (platino) y obtener réplicas de carbono para su observación con el MET, que permite una mayor resolución y aumento.
En conclusión, el conocimiento de la organización celular se ha desarrollado con la aparición de microscopios cada mas más perfeccionados, hasta el momento actual, en el que se emplean tecnologías de vanguardia para desentrañar los aspectos más ocultos de la estructura y del funcionamiento de las células.
Las técnicas histológicas y citológicas han permitido conocer la forma en que las células de un mismo organismo pueden presentar diferencia notables y, al mismo tiempo, ser idénticas en su origen y en sus características genéticas.
Autora: Dolores María Osuna Barrero. Profesora de Biología / Geología del IES Muñoz Torrero. (Cabeza del Buey).
Fuentes: Biología Molecular. Alberts.
Biología 2. Editorial Bruño.
